朱 轩轩 ，周良雪，郭丽军  ，郭晓慧， 张田，王敏康^*

摘要: 目的: 以乳酸菌及盘基网柄菌为代表研究芸豆 PHA 对其增殖的影响。方法: 采用纸片扩散法观察芸豆 PHA 对乳酸菌增殖的影响; 采用液体振荡和贴壁培养观察芸豆 PHA 对盘基网柄菌生长增殖的影响。结果: 1) 乳酸菌培养 12 h，1 mg /ml 组滤纸片周围出现大的菌落，继续培养各浓度含芸豆 PHA 滤纸片周围均出现生长圈，对照组无生长圈; 2) 振荡培养 24h 时，低剂量各芸豆 PHA 组细胞密度比值最大，1mg /ml 组达 2. 25，高于 2. 5mg /ml 组细胞密度不随时间而增加，5. 0 和 10 mg /ml 组贴壁培养12h，盘基网柄菌不运动为死亡状态。结论: 芸豆 PHA 对不同种类生物的生长增殖具有广泛的调节作用，其作用呈明显的剂量 －效果关系。

关键词: 芸豆植物凝集素; 乳酸菌; 盘基网柄菌; 细胞增殖

中图分类号: Q935    文献标识码: A     doi: 10． 3969 /j． issn． 1004 － 311X． 2013． 01． 022

Effects of Phytohemagglutinin from Yunnan KidneyBean on Growth and Reproduction of Cells

                                                                               ZHU Xuan － xuan，ZHOU Liang － xue，GUO Li － jun，GUO Xiao － hui，ZHANG Tian，WANG Min － kang^*

( Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy，Ministry of Education; School of Life Sciences，Yunnan Normal University，Kunming 650500，China)

Abstract: Objective: To study the effect of phytohemagglutinin( PHA) on lactobacillus and dictyostelium discoideum’s growth and repro-duction. Method: The effects of PHA from Yunnan kidney bean on multiplication of lactobacillus has been observed and recorded by paper disk diffusion method; shaking culture system has been used to observe the effects of PHA from Yunnan kidney bean on multiplication of dictyostelium discoideum. Result: Experimental results showed that: 1) after 12 hours of lactobacillus culture，big colonies appeared around filter paper in the group of concentrations of PHA at 1 mg /ml，and continued culture different concentration of PHA，growth rings all ap-peared around pieces of paper，but growth rings didn’t appear in control group. 2) after 24 hours of shaking culture，the rate of cell density is the biggest in groups of Low concentrations PHA，the 1 mg /ml group reached 2. 25，when concentrations of PHA were more than 2. 5 mg /ml，cell density didn’t increase with the change of time，the 5. 0 and 10. 0 mg /ml group were cultivated by adherent culture for 12 hours，dictyostelium discoideum appeared no movement and acted as death. Conclusion: PHA plays a broad regulatory role on different kinds of creatures，the effects of the regulatory role shows a dose － effects depend manner. Key words: Phytohemagglutinin; Lactobacillus; Dictyostelium discoideum; cell multiplication

0      引言

凝集素( phytohemagglutinin，PHA) 是一种非免疫原性蛋白质，广泛存在于动植物及微生物中。豆类植物种子的 PHA 含［1］量尤为丰富，由 2 或 4 个单体组成，一个糖结合位点 。于敏等提取和比较 8 种豆类 PHA 凝集作用的研究发现芸豆 PHA的凝集血细胞的效果最强，说明芸豆中 PHA 含量较高多种动物的许多类细胞膜上可检测到具有糖结合专一性的蛋白质，且在其它生物体包括病毒、细菌、粘菌、真菌等的细［1］胞膜上也存在具有糖结合专一性的蛋白质 。这使得 PHA 与多种细胞发生作用成为可能。研究表明，PHA 除具有凝集血细胞、淋巴细胞、纤维细胞、精子等的作用，且具有抗癌及抑［3 －5］制病毒的作用 。作者实验室研究发现，芸豆 PHA 可有效抑制小鼠受精、胚胎着床，终止早、中晚期妊娠小鼠的胚胎发［6，7］ 。张丽芬等人研究可知低浓度芸豆 PHA 可加快小鼠胚育［8］ ［9］ 发现 PHA 对肺癌细胞存胎发育速度 。Wei － Ting Kuo 等在剂量依赖性抑制作用且随剂量增加肺癌细胞的凋亡现象越明显。棉花 PHA 对根际促生细菌菌株的胞外多糖具有凝集［10］作用 。王军等的琼脂纸片扩散法抗真菌活性测定实验发现［11］WKBLD 对真菌呈现出一定的抑制作用 。而 PHA 对细菌和真菌的具体作用效果及对剂量依赖性尚未有明确的说明。因此本实验主要以细菌乳酸菌( Lactoba-cillus) 及真菌盘基网柄菌 ( Dictyostelium discoideum) 为研究对象，分别采用纸片扩展法及液体振荡培养法探究芸豆 PHA 对细胞生长增殖的影响及剂量效应关系，以期从多个成面阐述芸豆 PHA 对不同种类生物细胞生长及增殖的作用，确定剂量效应关系。为了解相关的信号转导、调控机制及其药用价值的研究和开发提供理论和实验依据。

1      材料与方法

1. 1  材料

1. 1. 1  实验材料

芸豆 PHA: 从云南丽江产白芸豆中提取，双缩尿法测蛋白质含量，Sigma 公司标准检测凝集效价为 1 /256，即 4 μg /mL。［8］提取液经 0. 22 μm 滤膜过滤后 4 ℃ 存放待用。

乳酸菌( Lactobacillus) : 昆明雪兰牛奶有限责任公司生产的原味酸奶中分离纯化得保加利亚乳杆菌( Lactobacillus bul-garicus) 。

盘基网柄菌( Dictyostelium discoideum) : 野生型 AX2 细胞，美国加州大学( UC Davis) 再生医学实验室赵敏教授惠赠。

1.1.2    试剂

蛋白胨( Proteose Peptone) 、酵母粉 ( YEAST EXTRACT) 、牛肉浸膏 均为分子生化级( BR) ，Oxoid 公司; 硫酸链霉素( 医药注射产品批号: 120109，山东鲁抗医药股份有限公司) ;KH₂ PO₄ 、K₂ HPO₄ 、MgSO₄ 、MnSO₄ 、葡萄糖、( NH₄ ) ₂ COOH、 Tween － 80、Na₂ HPO₄ ·7H₂ O 均为分析纯，天津市化学试剂三厂; 琼脂( 食品级，石狮市狮头琼脂有限公司) 。

1.1.3    仪器

Motic 倒置显微镜( 型号: AE2000 麦克奥迪公司产地: 厦门) ; YPW － I 全温度摇瓶柜( 型号: SF11025AT 上海通特电讯设备厂) PN: 11025B2H。血球计数板、玻璃培养皿、24 孔培养板、锥形瓶。

1.	1. 4	培养基
		［12］	和HL－5	［13］	。
	MRS 固体培养基			液体培养基
1.	2	方法

1. 2. 1  纸片扩展法观察芸豆 PHA 对乳酸菌增殖的影响

将芸豆 PHA 配成 0. 1、0. 2、0. 5、1. 0、2. 0、5. 0、10. 0 mg /mL 7 个浓度实验组和 1 个生理盐水对照组。以纸片扩展法将含不同浓度芸豆 PHA 滤纸片( d = 9 mm) 贴到已涂布乳酸菌的 MRS 固体培养基中，每个浓度 4 个平行，37 ℃ 恒温培养箱中培养。每 12 h 观察一次乳酸菌增殖情况并拍照记录，培养 72 h 结束。重复实验 3 次。分析芸豆 PHA 对乳酸菌增殖的影响。

1. 2. 2  不同浓度芸豆 PHA 对盘基网柄菌增殖的影响配制含芸豆 PHA 分别为 0. 1、0. 25、0. 5、1. 0、2. 5、5. 0、10. 0 mg /mL 7 个浓度梯度的 HL － 5 液体培养基备用，对照组为纯培养基。

1) 振荡液体培养法检测芸豆 PHA 对盘基网柄菌增殖的影响: 以 2. 2 × 10⁵ 个·mL ^{－ 1} 细胞密度接种于含不同浓度芸豆PHA 培养基中，每个浓度 3 个平行样，于 22 ℃ 、180 r /min 振荡培养。血球计数板计数法每 12 h 记录一次细胞密度，培养 108h 结束。重复实验 5 次，计算各时段细胞密度比。细胞密度比 = 各实验组细胞密度 /对照组细胞密度

2) 贴壁培养观察芸豆 PHA 对盘基网柄菌生长的影响: 在24  孔板中每孔铺 1. 1 × 10⁵  个细胞，以含不同浓度芸豆 PHA 的HL － 5 培养基室温( 20℃ 左右) 贴壁培养，每个浓度 3 孔。12 h后观察盘基网柄菌生长情况，连续拍照并通过 imageJ 图像处理软件处理照片观察盘基网柄菌的生长状态及运动情况。实验重复 5 次。

2     结果与分析

2. 1  不同 度 PHA  乳酸菌生 的影响纸片扩展法实验观察结果知: 1. 0 mg /mL 组培养 12 h 滤纸片周围有少量大菌落形成，对照组及其余各组滤纸片周围无大菌落出现( 图 1) ; 继续培养，各实验组滤纸片周围均出现生长圈，对照组则无 ( 图 2 ) 。结果分析表明: 1. 0 mg /mL 组 12h 时最先对乳酸菌表现促进作用; 增加培养时间各实验组与对照组比均表现出对乳酸菌增殖的促进作用，各剂量组差异不明显。

图 1 培养 12 h 芸豆 PHA 对乳酸菌增殖的影响图中标尺长度为 7. 5 mm。

Fig. 1  Effects of PHA on multiplication of lactobacillus cultured after 12hoursIn this figure，scale length is 7. 5mm.

2. 2  不同 度芸豆 PHA   基网柄菌增殖的影响

2. 2. 1  振荡液体培养结果

由图 3 可知，培养早期小于等于 2. 5 mg /mL 各组的细胞密度明显高于对照组，24h 时比值达到最大，其中 1mg /ml 组达2. 25。继续培养低剂量各组均比对照组细胞密度增加快，而5.  0、10. 0 mg /mL 组细胞密度不随时间的变化而改变。结果表明: 低浓度芸豆 PHA 可加快盘基网柄的分裂增殖具有促进作用，高浓度的芸豆 PHA 对盘基网柄菌增殖具有抑制作用。

2. 2. 2  贴壁培养盘基网柄菌 12 h 结果如图 4 所示，采用 imageJ 软件对各组连续拍摄照片进行处理发现，和对照组比含 0. 1 ～ 2. 5 mg /mL 芸豆 PHA 组盘基网柄菌生长和运动均正常，差异不明显。5. 0、10. 0 mg /mL 高剂量组中细胞无运动现象，细胞体发黑表现为死亡状态。

3     讨论

在人体内乳酸菌是一种益生菌，其正常的生长繁殖对人类的健康具有重要意义。例如细菌性阴道病( BV) 是由于阴道微生态平衡失调，厌氧菌和阴道加德纳菌生长过盛，兼性厌氧性乳酸杆菌受抑制所引起的育龄期妇女常见的一种无阴道

黏膜炎症表现的感染性疾病 。因此，提高阴道乳酸菌数量，维持正常的阴道微生态平衡就成为治疗细菌性阴道病的关键。并且乳酸菌还具有良好的保健和医疗效果，具有阻止致病菌的定植，刺激肠道粘膜免疫功能，降低胆固醇水平［16］

持肠道菌群平衡等功能 。我们的实验结果显示芸豆 PHA［17］对乳酸菌增殖具有明显的促进作用，这与付弘贇 等乳酸菌为降解 PHA 的优势菌的结论是相呼应的。

图 2  培养 72 h 芸豆 PHA 对乳酸菌增殖的影响。图中标尺长度为 7. 5 mm。

a 对照组; b 0. 1 mg /mL 组; c 0. 2 mg /mL 组; d 0. 5 mg /mL 组; e 1. 0 mg /mL 组; f 2. 0 mg /mL 组; g 5. 0 mg /mL 组; h 10. 0 mg /mL 组。 Fig. 2 Effects of PHA on multiplication of lactobacillus cultured after 72 hours. In this figure，scale length is 7. 5 mm.

图 3  振荡培养下芸豆 PHA 对盘基网柄菌增殖的影响Fig. 3 Effects of PHA on multiplication of dictyostelium discoideum by shaking fermentation

近年来，条件致病性真菌感染的发病率和死亡逐渐增多，［18］而感染的发生和病原体的致病力、宿主的防御力密切相关 。盘基网柄菌作为一种简单的真核微生物，当食物供给已经耗尽或食物暴露时，盘基网柄菌便会形成和释放孢子细胞而执行无性繁殖的功能，使其能适应不利的环境条件而存活。实验在液体振荡及贴壁培养盘基网柄菌中发现高浓度芸豆 PHA［11］可有效抑制并杀死盘基网柄菌。这与王军      等的结论不完全相同，可能由实验菌种的选着及方法差异造成的，但本文方法更加准确直观地反映芸豆 PHA 对盘基网柄菌的作用效果接下来可对多种真菌进行实验，探讨芸豆 PHA 对真菌增殖影响的普遍意义。张丽芬等在小鼠胚胎的体外培养中发现，芸豆 PHA 在 50 ～ 100 μg /mL 的浓度时可促进胚胎的发育，在 1 ～ 2 mg /mL 时会导致胚胎细胞出现副凋亡( Paraptosis) ; 而浓度提［8］高到 2 mg 以上会导致细胞膜破裂 。

从目前的相关研究结果来看，芸豆 PHA 的确具有广泛的调节作用，表现为: 第一，对不同种类的生物都具有影响，从低等生物到高等动物都可产生影响; 第二，具体的影响或调节结果存在剂量 － 效应的密切相关作用。因此其信号转导通路应该是一种存在时间很早的共同调节通路，对不同种类的生物具有广泛的影响作用，作为药物来说，也使得其应用范围具有广泛性。在哺乳动物，凝集素信号途径作为补体激活的三条［19］途径之一发挥作用 。真菌细胞壁广泛存在 β － 葡聚糖和 α － 甘露糖，而 Dectin － 1 和 2 可分别识别 β － 葡聚糖和 α － 甘［20］露糖，从而在真菌免疫中发挥重要作用   。

PHA 同时具有受精抑制、早中晚期妊娠抑制、结合病原体以及可有效提高机体的免疫水平的作用，综上所述，芸豆 PHA 作为一种蛋白质类物质在一定剂量范围内不仅具有具有很好的避孕效果、促进阴道有益菌乳酸菌生长、防止性传播疾病的作用，也同时可能具有治疗真菌感染和调节抗真菌免疫的作用也有助于对其信号通路的认识和深入研究。 致谢: 实验完成得到了美国加州大学( UC Davis) 再生医学实验室赵敏教授、云南师范大学生命科学学院再生生物学实验室的大力支持，在此表示衷心的感谢!

图 4  24 孔培养板贴壁培养盘基网柄菌形态观察( 10 × 40)

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