王敏康   王昌梅        张丽芬

(生物能源持续开发利用教育部工程研究中心; 云南师范大学生命科学学院, 昆明, 650092)

【摘要】目前, 我国性传播疾病 (STDs) 患者人数急剧增加, 其中艾滋病(AIDS)已进入快速增长期。因此需要开发女性能主动采用的具有预防 STDs 功能的用品来保护自己免受感染。各种新技术中, 以局部使用的杀微生物剂最受关注。多种动物及人的实验证明, 植物凝集素可抑制受精,芸豆凝集素可直接抑制HIV-1 逆转录酶的活性, 减少HIV感染者的病毒载量。利用植物凝集素的受精抑制、与病原体结合以及提高机体免疫水平的作用, 有可能开发同时具有避孕和防治STDs的新型制剂。

关键词: 植物凝集素; 精子; 凝集; 避孕; 性传播疾病 (STDs)

1     避孕和性传播疾病 

计划生育是我国的基本国策, 避孕是涉及每个家庭的基本问题。尽管有新的使用方便的避孕药物和方法不断出现, 但由于目前国内外所面临的性传播疾病 (sexually transmitted diseases, STDs ) 包括艾滋病 (获得性免疫缺陷综合征, acquired immune defi-ciency syndrome, AIDS) 的威胁不断上升, 使得仅具有避孕作用的药物出现了很大的局限性。因此, 开发具有避孕和防治性传播疾病包括艾滋病的方法(药物) 是非常迫切和现实的需要。 

S T D s 是全球性的生殖健康和卫生防疫的难题。在美国前 10 位常见疾病中, STD 就有 5 种。在 20 多种 STDs 当中, 危害最大的是 AIDS^[1]。

目前防治 AIDS 的主要方法有: 使用避孕套、减少性伴以及生殖道感染的治疗。但由于在社会、经济上的性别不平等, 发展中国家的许多女性通常不能决定自己的性伴数量, 也不能让她们的性伙伴配合采取防护措施, 另有部分妇女对乳胶过敏而不宜使用避孕套。这些原因显著降低了安全套在控制人类免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV) 及其他 STD 蔓延中的作用。因此联合国艾滋病规划署和 WHO 提出迫切需要开发新的干预方法, 使女性能主动采用具有预防 STD 功能的新技术来保护自己免受感染。各种新技术中, 以局部使用的杀微生物剂 (microbicide) 最受关注^[2]。

2        杀微生物剂的需求与现况

杀微生物剂是指性生活前应用于阴道、宫颈或者直肠内, 能够直接杀灭或中和 HIV-1 等病原体的、人工合成的或天然的物质^[3,4] 。杀微生物剂与避孕套不同, 它的使用无须性伴侣的主动协同或知晓, 另外也不像避孕套那样在性交过程中存在一层隔膜, 因而在男性和女性中都有很高的可接受性。目前开发的杀微生物剂的剂型包括凝胶、乳膏、栓剂、泡沫、海绵或薄膜等, 有杀精子和无杀精子作用 2 类。理想的杀微生物剂应该达到如下要求,在阻断 HIV 传播的几个环节如阻止病毒黏附, 杀死或灭活病毒, 阻断与感染相关的受体等方面均能发挥作用; 广谱杀菌、无刺激性; 作用时间长、潜在用户易接受 ( 气味、颜色、易携带、使用方便) ; 稳定、保护或提高阴道正常菌群; 不被全身吸收; 有润滑作用并能提高性享受; 非处方药、便宜^[2]。

研究表明^[5], STDs 可以破坏人体正常生殖道上皮细胞形成的屏障, 增加 AIDS 病毒的感染机会, 所以开发一种能有效阻止 STDs 病原体的杀微生物剂,不但可以直接减少这些疾病的发生, 还可间接阻止 AIDS 病毒经生殖道传播。

最早进入临床试验的杀精子(杀微生物)剂是壬苯醇醚 (N-9 或 N29), 此药是已被批准多年的阴道用杀精剂, 体外研究表明能有效杀灭 HIV、生殖器疱疹病毒、沙眼衣原体和淋病奈瑟氏菌等病原体^[6,7]。 但其不良反应也不容忽视, 如男方局部不适、女方外阴瘙痒、阴道烧灼感等, 在一定的浓度下破坏阴道有益菌群, 增大局部感染的机会, 且上述不良反应与杀精剂的剂量相关。 2000 年, N-9 作为杀微生物剂完成了III期临床试验, 然而统计结果表明^[8], 使用 N-9 凝胶后 HIV 感染率高于安慰剂对照组,尤其是在使用阴道凝胶频率高的受试者中, 感染率竟然高出了 1 倍多, 其原因与 N-9 对阴道上皮细胞的损害有关。

至 2008 年, 有 20 个杀微生物剂产品已进入临床试验的各个阶段, 其中 6 个已结束或正进行 IIB/ III期大规模临床试验, 有4个已经宣布失败或被中止 (N-9、Savvy、Ushercell 和 Carraguard), 另外 2 个还在进行中(PRO-2000 和 BufferGel)^[9]。南非医学研究会(MRC)发表研究报告称^[10], 至 2008 年 9 月, 来自南非、津巴布韦、马拉维、赞比亚和美国 5 个国家的 3 099 名妇女参与有关 PRO-2000 和 BufferGel 的试验。试验分为 4 组, 有 2 组分别使用杀菌胶 BufferGel 和杀菌胶 PRO2000 (质量分数 0.5% 剂量), 另外 2 组分别使用安慰胶以及不使用杀菌胶作为对比。结果表明, BufferGel 基本上无预防 HIV 感染的作用, 而 PRO2000 可以使 HIV 感染率下降 3 0 % ^[10]。

如果以N-9为代表的杀微生物剂为第一代非特异性杀微生物剂的话, 第二代杀微生物剂是更加特化的杀微生物剂, 它们为阴离子物质, 作用于病毒的吸收和融合过程; 第三代杀微生物剂则高度特化, 它们能够抑制 HIV 复制或与特异性 HIV 受体结合, 其中就包含凝集素(phytohemagglutinin, PHA)^[11]。理论上来说, 阻断病毒进入靶细胞是预防 HIV 感染最有效的手段, 即“御敌于国门之外”。因此, 能阻止 HIV 进入靶细胞的抑制剂作为杀微生物剂具有显著的优

_势[11]_。

3           植物PHA与避孕

PHA是一类不同于免疫球蛋白的蛋白质或糖蛋白, 广泛存在于植物、动物和微生物中。它能与糖专一地、非共价地可逆结合, 并具有凝集细胞和沉淀聚糖或糖复合物的作用。1888 年 Stillmark 首次在蓖麻籽抽提液中发现,由于它具有使红细胞凝集的作用, 因此开始被称为植物血凝素。PHA 从来源上可分为植物 PHA、动物 PHA 与微生物 PHA; 按结合糖的类型, 大致可以分为 6 类: ① D- 甘露糖或 D-葡萄糖; ② N- 乙酰氨基糖; ③ N- 乙酰氨基半乳糖; ④ D- 半乳糖; ⑤ L- 岩藻糖; ⑥唾液酸^[12,13]。当然,植物 PHA 还有其它的分类方式, 1995年植物PHA 被定义为至少具有一个可与单糖或寡聚糖特异并可逆结合的非催化结构域的植物蛋白^[14] 。

已有的研究表明^[12], 植物 PHA 不仅具有凝集诸如血细胞、淋巴细胞、精子细胞等作用, 而且参与了生物体内的一些重要生理过程。受精是精 - 卵相遇并发生融合的过程; 卵透明带 (ZP)是精、卵识别结合的重要成分。细胞表面的糖复合物是细胞间作用的有效成分, 而精子与卵细胞表面也存在相应的糖蛋白物质, 并在受精过程中发挥重要作用^[15]。 PHA 受体广泛存在于雌、雄生殖系统中, Nicolson 等对仓鼠、大鼠和小鼠的研究表明^[16], 透明带和卵母细胞的质膜都含有多种 PHA 受体。

多种动物及人的实验证明, 植物 PHA 可抑制受精。1973 年, Oikawa 等报道了麦胚凝集素(WGA)可以阻止哺乳动物的受精^[17]。1974 年 Oikawa 等又报道了植物 PHA 可抑制仓鼠的受精^[18]。

1989 年首次报道了人卵透明带表面含有大量甘露糖残基^[14], 用刀豆凝集素封闭透明带表面的甘露糖残基, 或用 D- 甘露糖预处理精子, 均可特异阻断人类精 - 卵的识别与结合^[19]。 Macedo 等也观察到 PHA 可抑制海兔的受精^[20], 当预孵育精子时, 抑制海兔受精的半数抑制浓度 (IC₅₀) PHA 的范围是 4.1~135.5 mg/ml, 而预孵育卵母细胞时, PHA 的有效浓度范围是 0.7~33.4 mg/ml。魏玉珍等研究了人精子甘露糖受体 (mannose receptor, MR) 的表达与精卵融合的关系^[21], 他们采用去透明带金黄地鼠卵行精子穿透试验(SPA), 监测精卵相互作用, 结果表明: 穿透指数、结合指数均与精子 MR 表达率呈正相关。江澍等进一步的实验表明^[22], 人精子 MR 作用于仓鼠卵母细胞表面后, 可触发皮质颗粒反应, 并使皮质颗粒部分内容物转移到卵母细胞表面。从已有的相关研究看^[23], 在精 - 卵融合方面, 精子 MR 的表达是获能的结果及本质事件, 并借助其与卵透明带识别结合,受其诱导发生顶体反应。因而推论, 精子 MR 在精 - 卵膜融合中可能发挥某种介导作用。Gabriele等用带有荧光素的甘露糖化牛血清白蛋白(DMA)标记人精子^[24], 结果显示精子的 DMA 结合位点大部分局限于赤道段顶体下空间, 精子与去透明带地鼠卵培养时加入 DMA, 能阻止精子与卵结合及穿透, 提示人精子 MR 可能参与精卵融合。另外, 有关研究已证明输卵管和子宫内膜也含有大量PHA受体, 它们随动情周期的不同出现增加和降低的变化。这些变化与胚胎的早期发育和着床时期紧密相关。例如石运芝等的研究证明^[25]: PHA-E受体广泛分布于真孕和假孕小鼠子宫内膜腔上皮和腺上皮、蜕膜细胞表面及其周围的细胞外基质(ECM); 据此说明凝集素 PHA-E 受体与小鼠胚泡植入过程密切相关。刘彦威等通过小鼠的实验结果指出^[26]: 输卵管黏膜PHA染色在发情前期为弱阳性, 发情期、发情后期、间情期均为阳性;妊娠 7 d 也为阳性; 产后 1 d 转为阴性。王昀等的实验结果证明^[27], 伴刀豆凝集素 (ConA)和麦胚凝集素 (WGA)在人子宫输卵管壶腹部黏膜和子宫内膜的增生期和分泌期都是强阳性表达。输卵管壶腹部妊娠时其黏膜PHA结合特性的变化与宫内早孕时子宫内膜的变化相似; 而在宫内早孕时输卵管黏膜则未见这种改变, 仍保持分泌期的结合特性。王舟等研究了人正常、妊娠及慢性炎症 3 种状态下输卵管黏膜 PHA 受体表达及其相互关系^[28], 结果也得到了相似的结论。

Yamada 等观察了 PHA-P 对大鼠 1- 细胞期胚胎体外发育的效应^[29], 采用含0 g/ml, 10 g/ml和 20 g/ml PHA 的 RECM ( 大鼠胚胎培养液) 进行 24 h 的预培养, 然后移入无凝集素和葡萄糖的培养液中继续培养 96 h。结果 10 g/ml 组的囊胚发育率为 79.3%, 与对照组 (0 g/ml, 40 . 8%) 相比显著增加。然而,20 g/ml浓度的PHA-P预处理组的胚胎发生不规则变形, 然后退化。另外, 继续暴露在 10 g/ml PHA-P 的胚胎发育停止于 2~4- 细胞阶段。Wu 等观察到在小鼠怀孕的第 3 日或第 5 日, 每侧子宫角注射 50 mg 或 60 mg 的 Con A , 在大鼠怀孕的第 6 日或第 7 日, 每侧子宫角注射 200 mg 的 Con A 对着床和妊娠并无影响, 但是如果在小鼠怀孕第４日或大鼠怀孕第 5 日给予同样的 Con A, 可出现着床显著减少, 并伴随出现子宫蜕膜瘤; 另Con A 导致的蜕膜化是剂量依赖型的^[30] 。Sretarugsa 等在怀孕 3 d 的仓鼠子宫角使用 Con A 和 WGA 这 2 种凝集素^[31], 第 9 日解剖可见胚胎着床显著减少或不出现着床。组织学检查表明 Con A可引起子宫内膜上皮液泡化和子宫内膜鞘细胞层的水肿, 而 WGA 对子宫内膜无影响。陈蕙玲等的研究认为^[32], ConA 对小鼠具有抗早孕作用。

近来我们进行了芸豆凝集素对不同种类精子的作用和阴道给药对小鼠的避孕效果观察^[33], 结果表明, 人、小鼠、牛、羊和兔的精子在低浓度 PHA (100~800 mg/ml) 作用下 30 min就完全发生凝集,不同物种的精子凝集方式有所不同, 但不会致死;而>1 250 mg/ml 高浓度的 PHA 会使这 5 种精子完全制动并发生致死: 使人精子制动/致死的浓度为 1 600 mg/ml; 小鼠约为1 250 mg/ml; 牛为1 600 mg/ml; 羊为 1 875 mg/ml; 兔为 1 250 mg/ml。体内实验结果表明^[33], 经阴道给予 PHA 具有抗早孕的效果; 每天经阴道给予 PHA 具有 100% 的避孕效果。

综合上述工作, 可以推测在用于避孕和抗早孕机理方面, PHA 可能在 5 个环节发挥作用: ① 直接作用于精液或精子, 使其凝集或致死; ② 作用和干扰精子与透明带的识别过程; ③ 作用和干扰精子与卵母细胞的结合和融合过程; ④ 作用于早期胚胎发育过程, 高浓度使胚胎停止发育和退化; ⑤ 作用于着床期子宫内膜, 干扰胚胎的着床过程。

涂喜庆等研究了植物 PHA 对动物和人精子的凝集作用^[34,35], 观察到不同来源的植物 PHA 引起的精子凝集形式不同。在人体运用的初步结果表明, PHA 外用避孕栓粒使用得当时, 可以达到阻止受孕的目的。

植物PHA与HIV防治Balzarini 等的研究表明[36], 来源于几种植物的甘露糖结合凝集素可抑制 HIV 的复制。另外,  N-乙酰葡萄糖胺结合型凝集素可防止 HIV 进入 T淋巴细胞。这 2 类 PHA 在体外培养时还可以抑制人类 T淋巴细胞病毒Ⅰ从细胞到细胞的传播[37]。Balzarini等的实验结果显示[38], 短时间在碳水化合物结合试剂中预暴露HIV-1可表现剂量依赖型的防止树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3捕获非整合素(Raji/DC-SIGN)与病毒颗粒的有效结合, 随后与 C8166细胞的共培养中无合胞体(syncytia) 形成, 包括甘露糖特异性结合凝集素和乙酰葡萄糖氨特异性结合凝集素,  均具有以上作用。Balzarini 认为[39], 在碳水化合物结合蛋白(CBP,carbohydrate-binding proteins)-PHA中, 特别是与甘露糖和 N- 乙酰氨基葡萄糖识别的 PHA 在细胞培养中具有显著的抗病毒活性。

一些研究已证明[40-42]: 芸豆凝集素可直接抑制HIV-1 的逆转录酶和 - 葡萄糖苷酶, 该酶在 HIV-1外壳蛋白 gp120 的组装中发挥作用。同时, 芸豆凝集素还抑制 - 葡萄糖苷酶和 - 葡萄糖苷酶活性,而 - 葡萄糖苷酶在 gp120 的糖苷化中起作用[ 4 2 ] 。HIV-1 逆转录酶抑制剂可减少HIV感染者的病毒载量。这使抑制剂在对抗 HIV 中可能成为治疗药物[43]。Doncel认为[15], HIV病毒和精子与细胞膜的结合有一些共同点: 初级和次级的 HIV 与 细胞受体的结合,类似于精子和卵子的结合, 都是蛋白质三级结构调节的件及碳水化合物识别。所以, 可通过干扰这些分子间作用的复合物, 从而作为杀微生物和避孕双重作用的候选者。

有关PHA对抗HIV病毒的作用可表现在5个方面: ① 作为 HIV 病毒进入细胞的抑制剂; ② 直接抑制HIV-1逆转录酶的活性; ③ 干扰病毒外壳gp120的组装; ④ 减少 HIV 感染者的病毒载量; ⑤ PHA 有可能通过提高 T 淋巴细胞转化率, 提升免疫力或提高AIDS 患者的 CD4 和 CD8 水平。因为动物试验已证明[33,44], 不同途径给予PHA都能提高动物整体的T淋巴细胞转化率。

由于价格昂贵, 有关报道的植物PHA仅作为工具药物或检测试剂用于受精机理和对生殖细胞及生殖道表面受体的研究。Balzarini 也指出[11], 虽然PHA可有效地阻止 HIV 的感染和传播, 但大量生产这些蛋白质的费用也许会阻碍它们的广泛运用。

5植物PHA对胚胎发育的影响及安全性

        评价

       采用植物PHA作为避孕及预防性传播疾病的另一个优点是它对胚胎发育无不良作用。在不同目的实验中加入 PHA 到胚胎操作液或培养液中, 例如在细胞核移植中需采用 PHA 把供体和受体细胞粘合,然后实施电融合。Wang 等比较了美洲商陆凝集素(PWN)和 PHA对牛卵母细胞体外成熟和着床前胚胎发育的影响[45],在含 PHA 的培养液中, 胚胎的发育显著好于前者。Du 等在牛体细胞核移植中采用 150 g/ml 浓度的PHA-L 处理 20 min 供体细胞[46], 结果融合效率显著提高。经过处理的克隆胚胎随后进行玻璃化冷冻和胚胎移植, 结果胚胎的存活率和妊娠率在处理组和对照组间比较无差异; 经胚胎移植后, 有 3 只牛犊出生, 其中 2 只是经过 PHA 处理的。Gupta 等观察到[47],在培养液中添加PHA可改善猪的孤雌激活胚胎和体细胞克隆胚胎的囊胚发育, 促进囊胚的扩张和孵化,以及增加总的细胞数目并减少细胞的凋亡, 但对体外受精的胚胎无明显影响。麦佩瑜等研究了 PHA 的半数致死剂量[48], 表明PHA 属于低毒致突变性的各项指标显示阴性, 而致畸试验中, 高、中、低剂量的各组孕鼠体质量均增长, 未见死亡; 各组胎鼠平均体质量、骨骼发育各项指标及异常胎鼠数、胎鼠平均尾长与阴性对照组比较均无统计学差异; 但胎鼠平均身长差异有统计学意义。这与我们在小鼠上的实验结果有所不同, 我

们对孕鼠从阴道给予 10~15 次的 PHA (每次 0.1 ml,浓度 80 mg/ml) 凝胶制剂, 结果出生仔鼠数、仔鼠体质量和初步的形态学观察均与对照组无明显差异 [33]。最近许巧丽进行芸豆 PHA 的药效学及安全性评价实验^[49], 结果也认为 PHA 无致突变和遗传毒性, 初步认为是安全可靠的。我们实验室完成的对小鼠精子致畸和亚慢性毒性实验也证明了芸豆凝集素无致畸和致毒性作用^[33]。采用 PHA 作为避孕及预防 STDs, 已在美国申请了专利并在 2004 年发布^[50]。该专利认为, 除可与精子结合而阻止精卵结合, 达到避孕外, PHA 还可与细菌、病毒, 包括 HIV 病毒结合而阻止这些病原微生物与生殖道上皮的接触, 从而有效阻止 STDs 的传播。

6       展望

综上所述, 植物 PHA 是一种同时具备了在不同环节作用于精子、卵子和生殖道上皮的天然物质,另外它也具备了抑制 HIV 病毒与靶细胞的结合和进入; 抑制病毒 RNA 的逆转录, 降低病毒载量; 在体外抑制病毒在细胞间的传播作用。 因此, PHA 是一种潜在的、较好的可用于阴道和直肠的具有避孕和预防包括艾滋病在内的 STDs 作用的杀微生物剂, 它属于国际上先进的第三代高度特异性杀微生物剂。可采用的首选剂型为润滑剂或凝胶, 其次可考虑采用崩解片的方式。上述剂型具有可单向使用、容易接受、方便携带和较低价格的优点。

云南白芸豆具有安全、优质和产量大的特点,由于大面积和规范的种植以及本身作为食品, 这就保证了可以得到大量高品质和价格较低的原料, 这与其它野生天然原料相比更为有利。在豆类凝集素的提取方面, 我们建立了一种高效的提取技术(发明专利申请号: 200910094233.1) 。

通过对上述 PHA 的抑制受精、终止早孕的深入研究探讨其作用机制以及在对抗HIV方面进行实验检测, 将有助于明确将PHA及其组合物作为具有避孕、终止早早孕和抗艾滋病毒的新型杀精子剂的可能性及可行性, 为进一步研究和开发利用提供基础。

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                               本文选自《生殖与避孕》