［摘要］ 目的:研究不同浓度的白芸豆提取物 PHA( 植物凝集素) 对小鼠胚胎体外发育的影响。方法: 实验一，采用添加不同浓度 PHA 的 M16 培养液培养小鼠 2-细胞期胚胎，观察 72 h 后的发育情况，记录囊胚及各阶段胚胎的数目。实验二，用与实验一相同浓度的 PHA 预处理从 1-细胞到囊胚不同发育阶段的胚胎 24 h，然后移入不含 PHA 的培养液中继续培养，观察到囊胚或孵化囊胚的发育率。结果: 含低质量浓度 PHA 的培养液有促进小鼠胚胎发育的作用，即 50，100 mg·L ^{－ 1} 的 PHA 可显著增加囊胚的数量。而含高质量浓度 PHA( ＞ 1 000 mg·L ^{－ 1} ) 的培养液会使胚胎发育停滞在 1-细胞到囊胚的不同时期，并随浓度增加表现为副凋亡或致死现象。结论: 不同浓度 PHA 可对小鼠胚胎的体外发育具有不同的作用。1-细胞阶段的胚胎对 PHA 处理具有较高的敏感性。在作用时间上，24 h PHA 预处理即可表现出对胚胎发育的促进或抑制作用。低浓度的 PHA 可促进胚胎发育，而高浓度的 PHA 则导致小鼠胚胎发育停滞，出现副凋亡或死亡。

［关键词］ 芸豆植物凝集素; 胚胎培养; 胚胎发育

凝集素( phytohemagglutinin，PHA) 是一类不同于免疫球蛋白的蛋白质或糖蛋白，广泛存在于植物、动物和微生物中。它能与糖专一地、非共价地可逆结合，并具有凝集细胞和沉淀聚糖或糖复合物的作用。豆科植物的凝集素由 2 个或 4 个单体组成，每个单体的相对分子质量为 25 ～ 30 kD，有一个结［1-3］ 。已有的研究表明，植物凝集素不仅具合糖位点有凝集诸如血细胞、淋巴细胞、精子细胞等作用，而且参与了生物体内的一些重要生理过程。受精是精卵相遇并发生融合的过程，卵透明带( ZP) 是精卵识别结合的重要成分，细胞表面的糖复合物是细胞间作用的有效成分，而精子与卵细胞表面也存在相应［4］ 。的糖蛋白物质，并在受精过程中发挥重要作用另外，许多研究表明，植物凝集素可抑制 HIV 的复制和防止 HIV 进入 T 淋巴细胞。研究已证明芸豆 Phaseolus vulgaris 凝集素可直接抑制 HIV-1 的逆转录酶和 β-葡萄糖苷酶，该酶在 HIV-1 外壳蛋白 gp120 的组装中发挥作用。同时，芸豆凝集素还抑制 α-葡萄糖苷酶和 β-葡萄糖苷酶活性。α-葡萄糖苷酶在 gp120 的糖苷化中起作用 。这些性质和特点有可能使植物凝集素成为避孕和预防性传播疾病［1］包括艾滋病的候选者 。以往的研究中发现植物凝集素可在不同阶段对［6-8］，受精和胚胎发育产生影响 其作用结果表现具有［6］种类和量效依赖作用 。但已有的报道所用 PHA 浓度梯度范围不大，不易判断所起作用的 PHA 浓度。因此进行不同浓度梯度 PHA 对胚胎发育的影响研究，有助于找到适用于促进或抑制胚胎发育的有效浓度和使用剂量，同时也有助于研究植物凝集素的作用途径和机制，并为将来的实际应用提供参考依据。本研究实验一采用从云南白芸豆中提取的PHA，通过小鼠 2-细胞胚胎培养来观察不同浓度梯度的 PHA 对胚胎形态和发育的影响。在实验二中，把不同阶段的小鼠胚胎用不同浓度的 PHA 进行 24h 预处理，然后把胚胎移至不含 PHA 的培养液中继续培养，观察记录胚胎的最终发育情况。以了解不同发育阶段的胚胎对 PHA 是否表现不同的敏感性。

       1 材料和方法

1. 1 植物凝集素的提取和纯化 植物凝集素为本实验室从云南产白芸豆中提取，PHA 的蛋白质含量采用双缩脲法测定，凝集活性按 Sigma 公司标准检测，即将 PHA 按 1 g•L － 1 配制成基础液，然后倍比稀释成 1 /2，1 /4，1 /8 ……1 /512 浓度的稀释液，取50 ～ 100 μL 再和等体积的 2% 的人血球混匀，25 ℃静止 2 h 后观察血球的凝集情况。本实验所用的效价为 128，即凝集活性为 8 mg•L － 1 。提取液经旋转蒸发仪浓缩为 50 g•L － 1 ，再经 0. 22  m 滤膜过μ滤后 4 ℃ 冰箱保存备用，为粗提 PHA 组; 粗提液经初步纯化( 纯化方法参照郑白玉等的布包纯化［9］ ) 后测定蛋白质浓度和活性，经 0. 22 μm 的微法孔滤膜过滤后 4 ℃ 冰箱保存备用，为纯化 PHA 组。

 1.2动物及处理  供试小鼠为雌性和雄性昆明种小鼠，体重 25 ～ 30 g，购于四川省医学科学院实验动物研究所。饲养条件为人工控温 22 ～ 26 ℃ ，14L /10 D 光照，自由饮水取食。取 6 ～ 10 周龄雌鼠经皮下注射 7. 5 ～ 10 U 的孕马血清促性腺激素( PMSG，杭州动物药品厂) ，间隔 48 h 后腹腔注射同样剂量的人绒毛膜促性腺激素( hCG，丽珠集团丽珠制药厂) ，注射 hCG 后与雄鼠合笼，次日上午检查阴栓，有栓者于注射 hCG 后 43 ～ 47 h 断颈处死，分离取出输卵管部分，洁的卫生纸上除去血液，然后置于 M2 － 培养液中。在实验 1，用冲卵针从喇叭口用 M2 － 将 2-细胞胚胎冲出来，M2 － 中洗 3［10］ 。实验2 中 1 ～8 细胞阶段胚次后就可进行培养胎的收集: 见栓第 1 天取 1-细胞、见栓第 2 天取 2-细、见栓第 3 天上午取 4-细胞、下午取 8-细胞，将小鼠断颈处死，分离取出输卵管部分，于清洁的卫生纸上除去血液，然后置于 M2 － 培养液中。用冲卵针从喇叭口用 M2 － 将胚胎冲出来，经胚胎吸管移入0. 1 mL 的 M2 － 中洗 3 ［10］ 。桑椹次后就可进行培养胚及囊胚的收集: 见栓第 4 天上午取桑椹胚、下午取囊胚，其他操作和前面一样，不同之处是处死小鼠后分离取出子宫部分，用冲卵针冲洗子宫获得桑椹胚或囊胚。

1. 3  培养液 M16 和 M2 － 的配制按照文献［11］。对照组为 M16 培养液。实验 1 中不同浓度实验组为在 M16 中加入粗提或纯化的 PHA，使 PHA 的质量浓度分别为 50，100，200，500，1 000，2 000，5 000mg•L － 1 。其中纯化 PHA 只有 50，100 mg•L － 12 个质量浓度。实验 2 的 PHA 浓度同实验 1，但 PHA 均为粗提物，另外，多 1 组 10 000 mg•L － 1 的处理组。

1. 4  胚胎培养 分别用 M16( 对照) 、含纯化 PHA以及含粗提 PHA 的 M16 ( 共 10 组) 在 35 mm 培养皿( 美国 Corning 公司) 中做成培养滴 ( 每滴约 20μL) ，然后覆盖上无菌的石蜡油，放入 5% CO2 培养箱中平衡1 ～2 h 备用。收集洗净的 2-细胞胚胎，平均分为相应的 10 组，然后将胚胎移入培养液小滴中，置于 37 ℃ ，5% CO2 ，95% 空气，饱和湿度的CO 培养箱中培养 72 ～ 96 h，每 24 h 取出观察 12次，72 h 后记录每组的发育情况。实验重复 6 ～ 8次。在实验 2 中，将胚胎平均分组，在含不同浓度PHA 的培养液中预处理 24 h，然后取出，在 M2 － 中清洗 3 次后移入 M16 + PVA 培养液中继续培养。记录囊胚及各阶段胚胎的数目。对于囊胚阶段培养的胚胎，则再培养 24 h，记录到达孵化囊胚的胚胎数

目。实验重复 5 次。

1. 5  数据统计  实验结果用 χ2 检验进行统计学处理。

     2  结果

2. 1  不同浓度 PHA 对小鼠 2-细胞胚胎体外培养的影响  纯化 50 mg•L － 1 组中的胚胎形成囊胚的比率( 90. 9% ) 最高，纯化 50 mg•L － 1 和粗提 200 mg•L － 1 组的胚胎发育到囊胚的比率与对照组相比有显著差异( P ＜ 0. 05) ; 纯化 100 mg•L － 1 ，粗提 100 mg•L － 1 组的胚胎发育到囊胚的比率都比对照组高，但是差异不显著。纯化 50，100 mg•L － 1 和粗提 100，200 mg•L － 1 组中胚胎形成孵化囊胚的比率均显著高于对照组( P ＜ 0. 05) 。而含 1 000 mg•L － 1 PHA

的试验组中，只有极少数的胚胎能发育到桑葚胚，绝大多数胚胎都停滞在 2-细胞和 4-细胞时期了，在含2 000，5 000 mg•L － 1 PHA 的试验组，胚胎基本完全停滞或在 2-细胞时期或退化( 表 1，图 1) 。

2. 2  不同浓度 PHA 对不同阶段小鼠胚胎体外发育的影响  200 mg•L － 1 PHA 预处理 8-细胞组及 200，500 mg•L － 1 预处理桑椹胚组，胚胎发育为囊胚的比率高达 100% ，除了预处理 1-细胞组，低浓度的 PHA预处理组的囊胚数及比率都高于对照组，但不是所有的组和对照比较都有显著差异，而预处理 1-细胞组中，低浓度 PHA 预处理组反而低于对照组。高浓度 PHA 预处理组的囊胚数及比率都显著低于对照组。同时，在对照组及各个 PHA 浓度组中，随着胚胎发育时期的增长，小鼠胚胎体外培养发育为囊胚的比率增加( 表 2) 。

      3  讨论

在 M16 中加入低浓度的 PHA 可促进小鼠胚胎从 2-细胞培养至囊胚，效果比对照组好，并且低浓度的 PHA 能使小鼠胚胎发育稍快一些，表现在致密化和形成囊胚腔的速度比对照组的胚胎快 6 ～ 8 h。试验结果中发现同样浓度的粗提 PHA 对小鼠胚胎

		表 1	不同浓度 PHA 对小鼠 2-细胞胚胎体外培养的影响( 72 h)
PHA	胚胎数	试验次数					不同发育阶段的胚胎数( 胚胎率 /% )
/mg·L － 1
				4～8细胞		桑葚胚				囊胚		孵化囊胚			碎片化
对照	69	6		63( 89． 9) a		58( 84． 1) a			56( 81． 2) b			9( 16． 1) b			4( 5． 8) a
纯化 50	66	6		63( 95． 5) a		62( 93． 9) a			60( 90． 9) a			29( 43． 9) a			3( 4． 5) a
100	66	6	63		( 95． 5) a	61	( 92． 4) a		58	( 87． 9) a		22	( 33． 3) a		3	(4．5)	a
粗提 50	67	6		62( 92． 5) a		59( 88． 1) a			56( 83． 6) b			17( 25． 4) b			5( 7． 5) a
100	67	6	62		( 92． 5) a	60	( 89． 6) a		57	( 85． 1) b		20	( 29． 9) a		5	(7．5)	a
200	67	6	63		( 94． 0) a	62	( 92． 5) a		60	( 89． 6) a		25	( 37． 3) a		6	(9．0)	a
500	66	6	57		( 86． 4) a	54	( 81． 8) a		50	( 75． 8) b		10	( 15． 2) b		6	(9．1)	a
1 000	72	7	24		( 33． 3) c	7	( 9． 7) c		0	( 0)	c	0	( 0)	c	0	( 0) c
2 000	68	6	3		( 4． 4) c	0	( 0)	c	0	( 0)	c	0	( 0)	c	0	( 0) c
5 000	69	6	0		( 0) c	0	( 0)	c	0	( 0)	c	0	( 0)	c	0	( 0) c

a: b

表示 P ＜0. 05;

a: c

表示 P＜0.01( 表2

同) ; 孵化囊胚 = 孵化囊胚数 /囊胚数 × 100% 。

注: 同一列中实验组与对照组比较，

发育的促进作用与纯化 PHA 的作用相比稍差一些，这可能是粗提液中还含有其他的蛋白质或杂质，而纯化 PHA 这方面的干扰相对较少。在试验中采用粗提 PHA 是因为可大大节约 PHA 分离、纯化的成本。Yamada 和 Utsumi 观察了 PHA-P 对大鼠 1-细胞期胚胎体外发育的效应。采用含 0，10，20 mg•L － 1PHA-P 的 RECM( 大鼠胚胎培养液) 进行 24 h 的预培养，然后移入无凝集素和葡萄糖的培养液中继续培养 96 h。结果 10 mg •L － 1 组的囊胚发育率为79. 3% ，与对照组( 40. 8% ) 相比显著增加。然而，20 mg•L － 1 PHA-P预处理胚胎组的胚胎发生不规

    

        

       

则变形并退化。另外，继续暴露在 10 mg•L － 1 PHA-［12］P 的胚胎发育停止于 2 ～ 4 细胞阶段 。与他们的结果比较，总的趋势相同，即低浓度的 PHA 有促进胚胎发育而高浓度的 PHA 导致胚胎死亡。另外，在他们的实验中，连续暴露在低质量浓度 ( 10 mg • L － 1 ) PHA 中的大鼠 1-细胞胚胎只能发育到 2 ～ 4 细胞阶段就停止发育，而本结果是在整个 72 ～ 96 h 的体外培养中都在含 PHA 的培养液中。这些差异的原因可能与所用 PHA 的来源及纯度以及物种差别有关。例如，Wang 等的实验发现，商陆凝集素对胚胎的发育起有害作用，而来自红芸豆的 PHA 在分裂率，桑葚胚和囊胚的发育率和对照组没有显著差［13］ 。由于该实验仅有 1 个 PHA 浓度，所以无法别全面判断浓度因素对牛胚胎发育的作用。在本实验中，由于高浓度 PHA 处理的小鼠 2-细胞胚胎仍然停留在 2-细胞阶段，所以推测其发生作用的时间在培养的 24 h 内。这和 Yamada 等在大鼠胚胎上得到的结果相同。在含 1 000 mg•L － 1 PHA 的实验组中，只有很少的囊胚能发育到桑葚胚，而绝大数胚胎都停滞在2-细胞和 4-细胞时期，而高质量浓度的 2 000，5 000mg•L － 1 试验组，胚胎基本完全停滞在 2-细胞时期，这就表明高浓度的 PHA 会使胚胎发育停滞并死亡。观察也发现高浓度中死亡胚胎的形态有差异，其中

1 000 mg•L － 1 组中近半数的胚胎一个卵裂球破裂，另一个卵裂球收缩变形，细胞质体积增大，内部出现空泡化。这符合副凋亡( paraptosis) 的情况，即细胞体积变大，电镜下可见细胞内出现大量由线粒体和［14］ 。Ebner 等研究了人

内质网肿胀形成的胞浆空泡卵母细胞从收集到 IVF( 体外受精) 或 ICSI( 细胞质精子注射) 过程直到囊胚期的空泡化与胚胎发育情况的关系，结果指出，空泡化出现越晚，对囊胚的形［15］ 。Hoa 等采用大鼠的 T9 胶质瘤细胞成危害越大研究了副凋亡的分子机制，证明副凋亡可通过钾离子通道依赖过程启动，而该过程由活性氧分子触发。细胞的裂解是以耗尽细胞质内的 ATP 为先决条件的。钾离子通道激活后可引起热休克蛋白( Hsp 60，［16］ 。70，90 和 gp96) 的过度表达

2 000 mg•L － 1 组中胚胎的细胞质完全退化，少数胚胎的细胞膜破裂; 5 000 mg•L － 1 组中的所有胚胎的细胞膜都破裂。这反映了更高浓度的 PHA 对细胞代谢或细胞膜结构产生的影响更加强烈。200 ［4 ］mg•L － 1 PHA 预处理 8-细胞组及 200，500 mg•L － 1预处理桑椹胚组，胚胎发育为囊胚的比率高达 ［5 ］100% ，除了预处理 1-细胞组，低浓度的 PHA 预处理组的囊胚数及比率都高于对照组，这表明 PHA 对各 ［6 ］个阶段的小鼠胚胎发育有一定的促进作用，但不是

所有的组和对照比较都有显著差异，这可能是因为有些组的量和预处理时间没有达到最佳作用效果。 ［7 ］而预处理 1-细胞组中，低浓度 PHA 预处理组反而低于对照组。这可能是因为 1-细胞本身比较敏感。本实验从体外培养方面证明了低浓度的 PHA 对小鼠胚胎发育的促进作用，而高浓度的 PHA 对胚胎发育具有抑制作用。同时，处理时间也是一个主要的影响因素。Du F 等在牛体细胞核移植中采用 150 mg•L － 1PHA-L 处理 20 min 供体细胞，结果融合效率显著提高。经过处理的克隆胚胎随后进行玻璃化冷冻和胚胎移植。结果胚胎的存活率和妊娠率在处理和对照组比较无差异。经胚胎移植后，有 3 只牛犊出生，其［17］ 。Gupta 等在培养液中 2 只是经过 PHA 处理的中添加 PHA 可改善猪的孤雌激活胚胎和体细胞克，隆胚胎的囊胚发育 促进囊胚的扩张和孵化以及增加总的细胞数目并减少细胞的凋亡。但对体外受精［18］ 。的胚胎无明显影响本实验观察了不同浓度 PHA 对小鼠胚胎发育的影响，结果表明 PHA 可直接作用于胚胎阶段，并以量效关系影响胚胎的发育，低质量浓度的 50 ～500 mg•L － 1 的 PHA 有促进小鼠胚胎发育的作用，而高浓度的 PHA 可导致小鼠胚胎死亡。这种高浓度的 PHA 使胚胎发育停滞或致死的作用应该是PHA 终止早孕的一个原因。值得注意的是，在别的

试验中发现，高于 1 000 mg•L － 1 的 PHA 可引起人、小鼠及其他动物的精子制动 /致死效应，而低浓度的［19］PHA 剂量则引起这几种精子的凝集，今后的工作需要进一步研究不同浓度 PHA 对胚胎发育影响的途径和机制等问题。

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Effect of phytohemagglutinin ( PHA )  from Yunnan white kidney bean on development of mouse embryos

ZHANG Lifen，WANG Changmei，YANG Mingjie，ZHANG Tian，WANG Minkang *

( Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy，Ministry of Education， School of Life Sciences，Yunnan Normal University，Kunming 650092，China )

［Abstract］ Objective: To study the effect of different concentration of phytohemagglutinin( PHA) on mouse embryo develop-ment. Method: In experiment 1，crude and purified PHA extracted from Yunnan white kidney bean with different concentration were added into M16 culture medium，the final concentration of PHA were: 50，100，200，500，1 000，2 000 and 5 000 mg•L － 1 respec-tively. 2-cell stage embryos were collected and cultured in PHA containing or control medium for 72-96 h and their development were recorded. In experiment 2，different stage of embryos from 1-cell to blastocyst were treated by different concentrations of PHA same as experiment 1 and 10 000 mg•L － 1 in culture medium for 24 h before washing and cultured in M16 + PVA without PHA to blastocyst or hatching blastocyst stage. Result: Low concentrations PHA at 50-100 mg•L － 1 promoted embryo development and increased the num-ber of blastocyst stage embryos． In contrast，high concentrations of PHA ( ＞ 1 000 mg•L － 1 ) blocked the embryos development from 1-cell to blastocyst stage and showed apoptosis morphology or death. Conclusion: Depending on the concentrations，PHA from white kidney bean shown promotion or inhibition on mouse embryo development. 1-cell stage embryo shown more sensitive to PHA treatment than that of later stage embryos. Pretreatment 24 h in PHA containing medium can influence the further development of embryos. Low concentrations of PHA is benefit to embryo development，but high concentrations of PHA ( ＞ 1 000 mg•L － 1 ) will block of the devel-opment of embryos.

［Key words］  phytohemagglutinin ( PHA ) ; embryo culture; embryo developmentdoi: 10． 4268 /cjcmm20111227