摘 要 目的:观察和比较自白芸豆中提取的植物凝集素 (PHA)对人、小鼠、牛、山羊和兔精子的凝集作用和整体给药的避孕和抗早孕作用。方法:体外实验中 ,在精液中加入不同浓度的 PHA,对使不同物种精子发生凝集作用影响因素进行观察, 高浓度 PHA制动的精子用相应获能液洗涤后复苏;在体内实验中, 对交配见阴栓后的雌鼠于不同时间一次性经阴道给予 PHA;另外不同时间间隔对正常性周期小鼠多次给予 PHA观察其避孕效果。 结果:体外实验结果表明 , 人、小鼠和牛的精子在低浓度 PHA(15.6 ～ 125μg/ml)作用下 30 min就完全发生凝集, 但不会致死, 不同物种的精子凝集方式有所不同。 凝集后的精子可以在室温下(22 ±7 ℃)存活 7 ～ 12h。 而≥250 μg/ml的高浓度 PHA会使这 5 种精子完全制动并发生不可逆致死。 并且在低 pH值时, 精子存活时间明显缩短。 体内实验结果表明经阴道给予PHA具有抗早孕的效果;每天经阴道给予 PHA具有 100%的避孕效果。结论:在体外实验中, 云南大白芸豆植物凝集素具有广泛的精子凝集作用;在体实验证明 PHA可有效用于避孕和抗早孕, 因此 PHA有可能开发成为具有外用避孕作用的药物。

关键词 植物凝集素 白芸豆 人精子 动物精子 凝集和制动 避孕药 doi:10.3969/j.issn.1004 -8189.2010.05.003

Studyontheeffectsofphytohemagglutinininprotectingagainstpregnancy WangChangmei, ZhangLifen, Yang Mingjie, etal.EngineeringResearchCenterofSustainableDevelopmentandUtilizationofBiomasEnergy.MinistryofEduca-tion, SchoolofLifeSciences,YunnanNormalUniversity,Kunming650092AbstractObjective:Toobservetheimpactofphytohemagglutinin(PHA)extractedfromPhaseolusvulgaris(whitekidneybean)onspermatozoaofdifferentspeciesinvitroanditscontraceptiveandanti-earlypregnancyeffectivenessinvivo.Meth-ods:Thespermatozoafromhuman,mice,catle,goatandrabbitwerepreparedrespectivelyintheircapacitatingmediumsbe-oredifferentconcentrationsofPHAwereadded.TheefectiveconcentrationofPHAandthedurationofspermaggregationwereobservedandrecorded.ThefemalemicewithvaginalplugornormalestruscycleweregivenPHAintravaginaly.Re-ults:Aftertreatmentwithlowconcentration(15.6 -125μg/ml)ofPHA, thedurationofaggregationinthespermatozoaofdifferentspecieswasabout30 minutes, butthespermatozoa

项目资助:国家自然科学基金(30560056;30860128);云南省中   couldn'tbekiled.Theaggregatedspermcouldsurvivefor7
青年学术技术带头人后备人才培养计划(2005PY01);云南省教				-12 hoursatroomtemperature(22 ±7℃).Treatedwith
育厅科研基金(5Z0239B;06Y1168)
收稿日期:2009		-06	-02	highconcentration(≥250μg/ml)ofPHA, thespermatozoa
修回日期:2009		-12	-01	ofdifferentspecieswereshockedandthendied.ThePHA
作者:王昌梅 云南师范大学生命科学学院(昆明, 650092)
张丽芬	云南师范大学生命科学学院			administratedvaginallyhadgoodefectsonprotectingagainst
杨明洁	云南师范大学生命科学学院
张 田	云南师范大学生命科学学院			pregnancy.Conclusions:ThePHAextractedfromwhitekid-
王敏康	云南师范大学生命科学学院

外用杀精子避孕药已成为一种安全、经济且效果良好的外用避孕法的首选, 但尚有一定的副作用, 如对外生殖器轻微刺激, 致少数妇女阴道分泌物增多等。寻找高效、安全并对胎儿发育无不良影响, 兼具抗性传播疾病 (STD)作用的杀精剂 [ 1] 成为研究方向。凝集素(PHA)是一种非免疫原性的蛋白质或糖蛋白, 在动物、植物及微生物(如细菌、病毒)中广泛存在。豆科植物的凝集素由 2 个或 4个单体组成, 每个单体的分子量为 25 ～ 30kD, 有一个糖结合位点 ^{[ 2]} 。 1989 年 Mori 等 ^{[ 3]} 首次报道人卵透明带表面含有大量甘露糖残基, 用刀豆凝集素封闭透明带表面的甘露糖基, 或用 D-甘露糖预处理精子, 均可特异阻断人类精 -卵的识别与结合。 Macedo等^{[ 4]} 也发现凝集素可抑制海兔的受精。凝集素不仅具有凝集诸如血细胞、淋巴细胞、精子细胞等作用, 而且参与了生物体内的一些重要生理过程, 近来还报道某些凝集素对艾滋病毒等也有抑制作用 ^{[ 5 ～7]} 。已有实验证明, 在多种豆类提取的植物凝集素中, 大白芸豆凝集素的活性较高^{[ 2]} 。本实验室比较了云南省多个产地的白芸豆样品所得植物凝集素的活性, 结果表明, 云南省丽江市的大白芸豆所得到的植物凝集素活性处于最高等级^{[ 8]} 。本项研究采用此植物凝集素对不同物种精子进行凝集试验, 以测定致精子凝集的有效浓度及完全制动浓度,以期为将植物凝集素开发成外用避孕药提供基础数据。

材料与方法

一、实验材料

1.PHA及相关处理     PHA(50mg/ml)为本实验室按自有方法从云南产白芸豆中的提取物,为淡黄色透明水溶液, 赋形剂分别为银耳多糖和羟基纤维素。其蛋白质含量采用双缩脲法测定, 蛋白电泳分析表明含有 7 ～ 8 个条带, 包括 32kD的凝集素部分。凝集活性按 Sigma公司标准检测, 效价为 256, 即凝集活性为 4μg/ml。提取液经 0.22μm的微孔滤膜过滤后保存待用。所用培养液有 PBS液、BO液^{[ 9]} 、SOF液^{[ 10]} 、T6 液、EF精子保存液^{[ 11]} 、BWW液 ^{[ 12]} 。精子染色采用考马斯亮蓝或次亚甲基蓝。

2.各种精子处理     ①牛、羊精子:为冻精 (云南省种畜场 )。从液氮灌中取出后,分别用 37℃和 38℃的水浴解冻, 并用预温的 BO液或 SOF培养液稀释, 1 000rpm/min离心洗涤 3

次, 调节精子密度(50 ～ 80)×10⁶ /ml, pH(7.6 ±0.4)。 ②人精子:取自成年健康男子(年龄 25 ～ 38岁), 禁欲 3 ～ 7d, 手淫法取精液于洁净试管内, 37℃, 0.5h内液化后置于 EF液 4℃ 保存, 使用前用 BWW液复苏, 光镜下常规检查, 调节精子密度为 50 ～ 80 ×10⁶ /ml, pH(7.6 ±0.4)。 ③小鼠精子:取 8 ～15周昆明小白鼠, 麻醉后取附睾尾部精子, 置 T6 培养液中于 37℃培养 5min, 待精子释放后采用双层擦镜纸过滤, 调节精子密度(50 ～ 80)×10⁶ /ml, pH(7.6 ±0.4)。 ④兔精子:取性成熟家兔附睾尾部精子, 置于 T6培养液中 37℃培养 5min,待精子释放后, 用双层擦镜纸过滤,调节精子密度(50 ～ 80)× 10⁶ /ml, pH(7.6 ±0.4)。

二、实验方法

1.不同浓度 PHA对精子的作用 依据参考文献[ 13] 并略加修改。 将准备好的精液 50μl加入含不同浓度的 PHA溶液中, 混匀后迅速取一滴于载玻片上, 室温(26 ±2℃)下连续观察 5个高倍视野,以全部精子失活(制动致死或者凝集)为终点, 测定同一时间点上的半数有效量 (IC₅₀)。 此外, 将0.1ml精液加入 0.1mlPHA溶液中, 充分混匀。 在 20s时检查精子, 如所有精子均凝集或死亡, 则再加入 0.1ml精液, 如此重复一直到最终发现活的未凝集精子。对不发生凝集作用的物种精子则观察其制动致死的情况, 每次均采用不同浓度的壬苯醇醚溶液(400, 200, 100, 50, 25μg/ml)及生理盐水对照。划分标准参照文献[ 14] 并作适当修改,每份标本重复 5次。

2.精子穿 PHA溶液玻片试验 将 20 μlPHA滴于载玻片上, 取等量含精子培养液相距约 4mm滴于同一载玻片上,轻盖上盖玻片后观察精子和 PHA溶液接触时的情况^{[ 15]} 。

3.不同 pH值对精子凝集作用的影响 取 62.5μg/ml PHA溶液, 用 1mol/L的 HCl调节 pH值分别为 3.75, 5.50,7.00, 8.50和 9.75, 观察不同 pH值条件下 PHA对不同物种精子凝集的影响。

4.PHA对精子的凝集方式 观察 PHA对精子的凝集方式时, 用移液器取已经发生凝集的精子少量 (20 μl)用滴片法 ^{[ 16]} 略加修改后制片:用移液器的吸头轻轻涂抹开, 自然空气干燥或风干, 滴加甲醇固定 5min, 干燥后采用 1%考马斯亮蓝或 1%次亚甲蓝染液染色约 10min, 冲洗后显微镜下(600 ×或 1 000 ×)观察。

5.PHA对促排卵处理小鼠的避孕效果 对 8 ～ 10周正常性成熟雌鼠进行促排卵处理, 注射孕马血清促性腺激素(PMSG)5U/只, 48h后再注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)5U/只,然后与雄鼠合笼,第二天上午检查雌鼠阴栓, 将每 20 只分为一组, 分别于妊娠当天及孕第 1, 2, 3, 5天用于实验。每只于下午 5:00 ～ 6:00一次性给予 0.1mlPHA(赋形剂为银耳多糖);对照组 4只小鼠, 给予相同剂量的赋形剂。另一组分别在妊娠当天及第 1, 2, 3天每只给予 0.1mlPHA(以 2%羟乙基纤维素的生理盐水溶液为赋形剂 ), 对照组每组 4只小鼠,给予相同剂量赋形剂。采用 NDJ-1型旋转式黏度计测定赋形剂黏度(绝对粘度为 14 250mPa· s)。 银耳多糖赋形剂的黏度略低于 2%羟乙基纤维素的粘度。

6.PHA对正常性周期小鼠的避孕效果 本实验将 8 ～ 10 周的正常性成熟雌鼠按每组 30只分成每天给药组,间隔 1, 2, 3, 4, 5d的给药组共 6组, 10只雌鼠 5 只雄鼠 1笼饲养。每只阴道给予 0.1ml以银耳多糖为赋形剂的 PHA, 对照组为 10 只雌鼠与 5只雄鼠, 仅给予相同剂量的赋形剂。实验时间为每天给药组 56d, 其余为 30d左右。 实验结束后将雄鼠捡出,延长观察 25d雌鼠的妊娠及产仔情况, 称量新生小鼠体重并测量体长、前后肢长等参数。

7.交配前测定 PHA的 ED50 参照文献对 8 ～ 10周正常性成熟雌鼠进行促排卵处理。 注射 PMSG5U/只, 48h后再注射 hCG5U/只, 然后各组小鼠阴道给予不同剂量 PHA(4, 2.15, 1.20, 0.77, 0.58, 0.50 mg/ml)。 然后与雄鼠合笼, 第 2 天上午检查阴栓, 有栓者用于实验, 每组 10只。对照组每组给予相同剂量的银耳多糖赋形剂。 见栓后 15d妊娠为阳性,未妊娠为阴性。用点斜法计算 [ 17] PHA对小鼠抗着床的 ED50 。

结 果

      一、不同物种精子的活力及活率 部, 少数头部贴底。 当 PHA浓度达到 250μg/ml时, 处理 30s

5种物种精子的存活率及活力见表 1。

      表 1 实验用不同物种精子存活和运动能力(%, x±s)

      物种      实验重复次数              精子存活率                          精子活力  

     人                8                       92.5 ±5.0                          65.5 ±2.5

    小鼠              8                       100.0                                75.5 ±8.5

     牛                8                       86.5 ±3.5                          67.5 ±6.5

     羊                8                       83.5 ±4.0                          63.5 ±5.5

     兔                8                       100.0                                68.5 ±3.5

二、不同浓度 PHA对不同物种精子的作用结果

       在实验中, 我们观察到 PHA对精子的作用方式与浓度有关。根据实验结果可将 PHA<250μg/ml定义为低浓度, 而在低浓度条件下 , 精子未凝集时用“ -”, 全部凝集用“ +”, 10%凝集 “ ±”表示;在高浓度 PHA条件下, 精子不发生凝集就全部制动或死亡用“0”表示。 “0”和“ -”的区别在于前者会随时间的延长发生凝集,而后者不发生凝集并逐渐死亡。由表 2可见, 在同等浓度的 PHA下 (62.5μg/ml)精子发生凝集的时间由短到长顺序为:小鼠精子 (2min)>人精子(10min)=牛精子 >羊精子(2h)。 此外, 我们还发现发生凝集的精子并非立即制动, 而是形成团块或网格状, 继续存活 6～ 8h。 从低到高浓度的 PHA对兔精子均无明显的凝集作用;但最低浓度(15.6μg/ml)PHA处理组中可看到处理 30min后95%以上的精子都不能游动, 大多数精子尾部贴于培养皿底部, 少数头部贴底。 当 PHA浓度达到 250μg/ml时, 处理 30s对精子无凝集作用即产生了制动(致死)效应。 对经高浓度PHA处理制动后约 10min的精子用相应获能液洗涤后进行复苏, 以此观察 PHA是使精子致死还是短时间休克。我们从10min开始观察, 每 1h观察一次, 一直观察到 5h后, 精子都处于失活状态, 可判断为精子已死亡。

       三、PHA对不同物种精子的凝集作用方式

       PHA对不同物种精子的凝集作用方式不相同。对人精子, (的凝集方式多为头尾相接呈串珠状 少数尾尾和头头方式 图1);对小鼠精子的凝集方式绝大多数为头头,少数是头尾和尾尾方式(图 2);对牛精子的凝集方式多为尾尾, 少数头头和头尾方式(图 3);对羊精子的凝聚方式是凝集成小团, 几种方式

					表 2		不同浓度试剂在 2min内对不同物种精子的作用结果
		药物		浓度			小鼠			牛精子		羊精子		兔精子	人精子
				(μg/ml)			精子
		PHA		1 000			0			0		0		0	0
				500			0			0		0		0	0
				250			0			0		0		0	0
				125			+			+		-		-	0
				62.5			+			+		-		-	+
				31.25			+			±		-		-	+
				15.63			±			-		-		-	±
				7.8			-			-		-		-	-
		壬苯醇醚		400			0			0		0		0	0
				200			0			0		0		0	0
				100			0			0		±		±	0
				50			±			±		-		-	±
				25			-			-		-		-	-
		生理盐水					-			-		-		-	-

        

         
       

        四、玻片穿透试验

        用人、小鼠、牛、羊和兔精子分别与各浓度 PHA所做的穿透试验结果发现, 无一精子能穿透。镜下观察见精液与 PHA 接触处有手指样突出 ,每一突出的交界面精子发生凝集或被制动, 并且随着精液与 PHA接触面积增大, 精子最后被完全凝集或制动。       

        五、不同 pH值对凝集作用的影响

        在 PHA同等浓度下, 低 pH值更易使 PHA对精子发生凝集作用, 试验中分别将 PHA浓度 62.5 μg/ml的 pH值调至3.75, 5.50, 7.00, 8.50, 9.75几个梯度, 结果显示, 在 pH 3.75时精子凝集作用明显比 pH9.75强而快, 并且发生凝集的团块活动时间也呈同等趋势, 即 pH值从高到低, 对精子的凝集作用及强度都呈梯度加强。本实验中人、小鼠、牛和羊的精子在 pH值 3.75时存活约 4 ～ 6h, 而在 pH值 8.5和 9.5 时可以存活约 5 ～ 12h。 兔精子不相互凝集, 但在 pH值为 3.75时存活时间短于碱性 pH值条件。

        六、PHA对促排卵处理小鼠的抗早孕效果

       由实验结果可看出,在交配后不同时间给予银耳多糖或羟乙基纤维素为赋形剂的 PHA(5mg/ml)都具有抗早孕作用,见表 3。

        七、PHA对正常性周期小鼠的避孕效果

        由实验结果可看出,阴道给予 PHA具有避孕作用。在每天 1次给予 PHA的正常性周期雌鼠, 57d的实验期内, 避孕率为 100%。间隔 1d给予 PHA的避孕率为 47%;间隔 2d避孕率为 33%;间隔 3d避孕率为 7%;间隔 4 ～ 5d的避孕率为0;对照组的总避孕率为 10%, 间隔 1 ～ 5d避孕率分别为 0, 10%, 0, 0, 0。观察表明,每日给予 PHA的实验组中, 有 3只小鼠见栓 8次, 4只小鼠见栓 7次, 其余多数见栓 3 ～ 5次。      

        八、PHA抗着床效应

        PHA的抗着床效应 ED50测试结果见表 4。由点斜法计算出 ED50是 2.74 mg/只小鼠, 95%可信区间是 2.42 ～ 3.10mg/只小鼠。

                    表4   不同浓度PHA抗着床效果

效果	4.0	2.15	1.20	0.77	0.58	0.50	对照组
妊娠数 /	1/10	3/10	4/10	5/10	8 /10	9 /10	9/10
总数

                                                                                      讨 论

         在自然条件下精子的运动能力是完成受精的一个最重要的前提, 在 PHA的作用下, 精子由于相互凝集而失去单独的运动能力, 有效精子浓度大大降低, 成为 PHA的一种独特作用方式。低浓度 PHA对羊精子发挥凝集作用非常慢,即使在μg/ml浓度下作用 1h后, 仍然还有单个精子活动;但在高浓度(≥250μg/ml)作用下, 实验所用的人、小鼠、 牛、羊和兔的精子均发生不可逆的制动(致死)作用。这也是外用杀精子剂要达到的效果。本研究观察, 使人精子制动(致死)PHA最低浓度约为5μg/ml, 小鼠为 125μg/ml, 牛 160μg/ml, 羊为 250μg/ml, 兔为 90μg/ml。本研究还发现, 高浓度 PHA对精子致死作用方式与其它杀精子剂的作用方式可能不同。 推测可能高浓度 PHA占据了精子细胞膜表面的相关糖蛋白和其它受体, 以及一些膜通道,导致精子不能正常代谢而死亡。因为在低浓度条件下, 精子虽然被凝集在一起, 但仍然可以存活几个小时。所以,有必要进一步研究有关机制。

涂喜庆等[ 18] 也利用 PHA制剂检验了经阴道给药对人精子凝集作用和对猪精子的凝集作用。结果表明, 绝大部分的精子都发生凝集和死亡。而且 30例受试妇女主诉无任何不适 , 取样时未发现阴道充血、水肿 (宫颈水肿)。 涂喜庆等^{[ 19]} 还观察了伴刀豆蛋白 A和 PHA对人和猪精子的凝集作用, 结果发现, 浓度为 0.25mg/ml的 PHA可使溶液中 60%的人精子发生凝集, 而 1mg/ml的伴刀豆蛋白 A可使精子致死。 本实验结果表明, PHA在高浓度时, 对人、小鼠、牛、羊和兔的精子均有致死作用, 这进一步扩大了 PHA作用的动物精子种类。

根据我们的实验结果, PHA的使用浓度为 50mg/ml, 这是根据小鼠和人的体外实验中高于 250μg/ml的 PHA对精子具有制动(致死)效应, 并假设每次 0.1 ～ 0.2ml润滑剂或凝胶的有效使用量所含的 PHA(5 ～ 10mg)即可使绝大多数人一次射出的 3 ～ 6ml精液的精子完全凝集或致死的剂量来决定的。

交配后给予 PHA的抗早孕作用并不理想, 从时间分析,见栓当天下午给予 PHA时小鼠卵已完成受精;见栓后 1或 2d 时受精卵已发育到 2细胞或 4细胞阶段胚胎。 PHA的抗早孕作用在受精完成 2d后就降低到约 50%了。 但 PHA实验后出生的小鼠身长、四肢等与对照组无差异, 表明 PHA避孕的安全性。 另外, Gupta等^{[ 20, 21]} 的研究表明, PHA可改善猪囊胚的发育并促进囊胚的扩展、孵化和囊胚细胞总数并减少细胞的凋亡。 Du等^{[ 22]} 检验了 PHA对牛体细胞克隆胚胎的研究表明, 用 PHA处理后(150 μg/mL, 20min孵化 ), 成纤维供体细胞的融合率有显著提高, 经玻璃化冷冻后胚胎的孵化率与对照组相似, 经胚胎移植后 PHA处理组出生 2只克隆牛, 对照组出生 1只克隆牛。以上动物及细胞试验也初步表明, PHA对着床前后胚胎发育是安全的。 我们的数据以及许巧丽 ^{[ 23]} 的实验结果也显示 PHA不会增加精子致畸和骨髓细胞微核发生率。此外, 采用 PHA作为避孕及预防性传播疾病,已在美国申请了专利并在 2004年发布。除可与精子结合而阻止精卵受精达到避孕效果外, PHA还可和细菌、病毒结合而阻止这些病原微生物与生殖道上皮的接触, 从而有效阻止性传播疾病的传播扩散。

(感谢云南省农业厅草山站吴维群研究员和云南省种畜场李春平站长为本研究提供动物精子)

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